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常規普通PCR常見問題

更新時間:2022-07-04瀏覽:1364次
1.瓊脂糖凝膠電泳后無PCR擴增產物條帶  
主要表現:Marker及對照條帶均正常,但檢測樣本無條帶。  
原因分析:1.反應條件不合適:PCR過程中退火溫度過高,退火延伸時間不足,反應循環數過少。  
2.核酸模板濃度或純度低:普通PCR的檢測敏感度有限,樣本核酸含量低或者含有抑制物。  
3.反應體系與核酸擴增不匹配:檢測體系中的Mg2+濃度,dNTPs量或Buffer與目標核酸擴增所需條件不匹配。  
4.引物設計不當或者發生降解:存在引物二聚體或二級結構,引物稀釋后未分裝儲存條件不適宜或者反復凍融次數過多。  
解決方案:1.優化反應條件,梯度摸索退火溫度,延長退火延伸時間,增加反應循環數(30-45區間為宜)。  
2.對核酸模板進行純化,或使用商業化核酸提取試劑盒進行提取,增加核酸模板的上樣量。  
3.優化反應體系(預混體系除外),改變檢測體系中的Mg2+濃度及dNTPs用量,更換體系中Buffer。  
4.重新設計引物,避免引物二聚體和鏈內二級結構,在一次稀釋引物后可分裝成多支小管,減少反復凍融次數。

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