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聊一聊數字PCR行業的基本概況

更新時間:2024-04-26瀏覽:1269次
  PCR(聚合酶鏈式反應)是指利用DNA 聚合酶(如Taq DNA 聚合酶)在體外條件下,催化一對引物間的特異DNA 片段合成的基因體外擴增技術。PCR 是生物體外的特殊DNA 復制,最大的特點是能將微量的DNA 大幅擴增。以實時熒光PCR 技術為例,通過PCR 技術進行分子診斷的主要流程包括:
  1. 核酸的提取和純化:使用核酸提取試劑從病毒、細菌等中提取出DNA;
  2. 核酸在引物約束下特異性的PCR 擴增:在提取的DNA 中加入擴增需要的反應液(酶、復制需要的原料、引物等),在PCR 儀中完成擴增過程;
  3. 擴增產物的檢測:通過熒光標記法檢測DNA 含量,從而判斷病毒DNA 含量,給出診斷結果。
  PCR 技術最大的特點就是靈敏度高、特異性好、及時方便,在基礎研究以及醫學診斷、法醫學和農業科學等各大領域應用廣泛。在臨床診斷中,PCR 技術具有諸多優勢:靈敏度高,靶細胞檢出率可達1/100 萬,病毒檢測靈敏度≥3RFU,最小細菌檢出率為3 個,檢測樣本純度要低,僅需DNA 粗提??;擴增反應在2-4 小時內完成,使用簡便、快捷。
  作為臨床診斷的“金標準”技術,PCR 廣泛應用于血站核酸檢測、疾控核酸檢測、臨床核酸檢測等領域,其中,在傳染病診斷和血篩檢測中,PCR 技術能縮短診斷的“窗口期”并且可以定量對病原體進行檢測,相比于傳統的免疫診斷方式,具有不可替代的優勢,基于PCR 技術的分子診斷是醫院對傳染病診斷的“金標準”。
  PCR 經過三代技術更迭,精確度和靈敏度不斷提高。PCR 技術最早由穆勒于1985 年發明,經歷了第一代定性PCR、第二代定量PCR 和數字PCR 三代技術迭代,其中第二代定量PCR 包括熒光定量PCR(qPCR)以及在其基礎上分化出來的ARMS (突變擴增阻滯系統)和HRM(高分辨溶解曲線)。三代技術的主要差異如下:
 ?、?第一代定性PCR 技術:采用瓊脂糖凝膠電泳對PCR 擴增產物進行分析,存在交叉污染、檢測耗時長、只能做定性檢測等缺點,目前處于衰退期,已基本被淘汰;
 ?、?第二代熒光定量PCR(qPCR)技術:qPCR 在一代定量PCR 的基礎上引入熒光探針標記法從而實現定量檢測,目前發展成熟、應用廣泛、臨床普及率高,為現階段主流應用平臺,正處于從成長期向成熟期過渡的階段,市場增速在20% 以上;
 ?、?第三代數字PCR(dPCR)技術:dPCR 是在PCR 原理的基礎上利用芯片和熒光檢測技術進行核酸絕對定量檢測。芯片技術是dPCR 的核心工藝,利用對樣品進行分液處理進而實現“單分子模板PCR 擴增”,達到定量檢測的目的,具有更高的精確度和靈敏度,目前處于導入期,市場增速在10%-15%。
  數字PCR儀的工作原理是,通過將含有待測樣本的數字PCR反應液分散到成千上萬個獨立的微反應單元中,在PCR擴增后對每個微反應單元中的熒光信號進行判讀,計算出陰性和陽性反應的數量,最后利用泊松分布等統計學公式和軟件對結果進行計算分析,從而實現靶標分子的絕對定量。因此,數字PCR不依賴標準曲線定量,并且不受PCR擴增效率影響,具有更高靈敏度和準確度。

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