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如何控制好數字PCR儀的溫度問題?看完你就知道了

更新時間:2024-04-26瀏覽:1299次
  對普通PCR儀來說,溫度控制指標主要是指溫度的準確性、均勻性、以及升降溫速度,對數字PCR儀來說,除了溫度的準確性和均勻性、升降溫速度以外,還必須考慮儀器在梯度模式和標準模式下是否具有同樣的溫度特性。
  溫度的準確性是指樣品孔溫度與設定溫度的一致性,它直接關系到實驗的成敗。如果排除樣品加入過程中的問題,對于PCR反應而言較重要的莫過于溫度控制的準確性,由于PCR是一個幾何級數擴增的過程,擴增過程中退火溫度的細微變化會被放大而直接影響結果,不論是變性、退火還是延伸都需要準確控制溫度,對退火溫度而言溫控顯的尤為重要,有時1度甚至0.5度的差異也能決定實驗的成功與失敗,所謂差之毫厘,謬之千里。因而對PCR擴增儀而言溫度控制就意味著質量。
  溫度的均勻性是指樣品孔間的溫度差異,它關系到在不同樣品孔進行反應結果的一致性。我們在實驗中發現有時用同樣的樣品,同樣的PCR反應程序,結果竟然差異非常明顯,或許就是因為不同位置的溫度不均一性所致。一些使用過早期PCR儀,腦子格外靈光的研究人員偏愛使用PCR儀中間某幾個固定的孔,就是因為過往反復的教訓和認真的思索得出了這樣的結論,數字PCR儀的溫度均勻性不好,特別是外周的樣品孔情況更差,很有可能影響實驗結果——即“位置的邊緣效應”會影響結果的可重復性。
  溫度控制除了均勻性,還有一個廠家喜歡大力宣傳的指標——升降溫的速度。更快的升降溫速度,可以縮短反應進行的時間,而且縮短了可能的非特異性結合、反應的時間,能提高PCR反應煌特異性。因此從本質而言溫控方式就從以前相對穩定耐用的機械式轉向了升降溫更快速的半導體。除了機械本身的原因,影響升降溫速度的還有制作承托樣品管的基座模塊的材料的導熱性。
  作為用戶來說,當然更愿意選擇升降溫速度快的,這就像汽車上好看的表面配置一樣容易看到,而內在的穩定性和耐用性往往是看不到的而容易被忽略。必須注意到,儀器的升降溫速度和樣品管中的樣品的升降溫速度并非同一回事,因為樣品管與基座接觸的緊密性、導熱性、鄰近樣品管的相互影響都會影響樣品的實際升降溫速度。
 

  現在的PCR儀一般具有兩種溫控模式,即模塊溫控模式和反應管溫控模式)。在模塊溫控模式下,機器根據探se器直接探se的溫控模塊(即承載樣品的金屬臺)的溫度進行控制,這種模式適用于長時間的靜態孵育(如連接、酶切、去磷酸化等)。反應管溫控模式實際上是一種模擬試管/PCR板的溫控模式,根據探se器所探測到的溫控模塊的溫度由計算機計算出管內/PCR板孔內樣品液的溫度來進行控制。一般說來,試管溫控更為準確,因為管內樣品的溫度無法與溫控模塊同時達到預設溫度。特別是PCR反應中的孵育過程一般都很短暫(30秒或更短),如果采用只有模塊溫控模式的話,反應混合物孵育的時間與程序設定的時間會有相當大的差距。而反應管控制的算法能自動補償時間,而且適合各種類型的反應管,確保反應混俁物按照程序設定的時間維持預設溫度。
  有的數字PCR儀廠家推出了另一種溫控方式;熱敏電極溫控模式。該方法將一個熱敏電極插入一個專門的測量管中(管中裝有礦物油),反應進行時,將該測量管插入溫控模塊的樣品進行檢測。他們認為通過此途徑可以監測反應管內樣品的實際溫度,但這種方法未免有些華而不實:(1)測量管中礦物油的溫度變化與實際反應樣品的溫度變化未必一致;(2)因為測量管必須占用一個樣品孔,所以使用該溫控方式時就無法使用96孔PCR板作實驗。

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